Western blot

Este jueves presenciamos la realización de una técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida, seguido de un western con su respectivo revelado.

La electroforesis consiste en la separación por tamaño, en este caso de proteínas, haciendolas correr por diferencia de carga (estas estan cargadas todas iguales por un tratamiento previo).

Esta técnica se preparan dos geles: el concentrador (no separa las proteínas, simplemente las alínea para que todas empiecen a correr a la vez) y el gel separador (el encargado de separarlas por tamaño)

En una cubeta para electroforesis se llena una una lámina de gel separador, se agrega alcohol arriba para evitar curvaciones en los costados (ya que la corrida va a ser vertical). Se deja solidificar, se tira el alcohol y se agrega el gel concentrador seguido del peine para formar las calles. Una vez que solidifica este segundo gel, se saca el peine y se procede a sembrar las muestras de priteínas previamente desnaturalizadas con SDS (ésto se hace para poder separar bien por peso molecular, y que la forma no influya en la corrida) con micropipeta. En la mezcla a sembrar (una muestra de crackeo, es decir una mezcla de proteínas extraídas desnturalizadas) se agrega azul de bromofenol, que al ser muy pequeño corre con el frente, y como es coloreado nos permite visualizar las instancias de la corrida. En la cubeta se pone el buffer adecuado, que va a proporcionar el medio por el cual puedan moverse las proteínas. En una calle se pone un indicador de bandas, que es como una "regla" que marca los diferentes pesos celulares visiblemente (quedan bandas de colores)



Una vez que el frente llegó abajo, se desarma el equipo, se saca el el gel y con cuidado de que este todo el tiempo mojado con buffer, se transpasa a una memrana. Una vez hecho esto, se deja incubar la membrana con una anticuerpo específico para la proteína de interes, y después de un tiempo, se deja con un segundo anticuerpo que reconoce al primero, pero que está marcado.



En este caso, el segundo anticuerpo tenía peroxidasa, y para el revelado se le agregaba luminol y agua oxigenada, generando una reacción de descomposicion del agua oxigenada combinada con el luminol que genera luz. A la embrana con los anticuerpos se le agregan los reactivos, y se la lleva a revelar. La máquima lo que hace es "sacar una foto" pero a oscuras, es decir, esta todo oscuro, y la máquina reconoce la luz que emite la muestra.



Después, se debe hacer un control de carga. Esto sirve para corroborar la relación de cantidades de proteínas. Es decir, uno puede obtener 2 bandas a la misma altura en dos calles diferentes, una más grande que la otra, pero no necesariamente eso quiere decir que la más grande contenga más concentración, ya que puede haber habido un error al sembrar o un factor externo. Por lo tanto, para corroborar esta diferencia, se revela la misma membrana contra un anticuerpo para otra proteína (una que sé que está presente y no fue modificada en ningún proceso anterior). Para obtener un factor que determine si la concentración es realmente mayor o no, se hace un cociente entre "el ancho" de las bandas de una misma calle (es decir, de las dos dferentes proteínas). Esto se logra con un programa de la computadora, que al seleccionar una cierta superficie, dice "cuan negra" está en unas unidades arbitrarias. Si las concentraciones son similares, el cociente entre los valores de una calle deben ser similares a el de la otra.
En el ejemplo de la izquierda, mirando solamente la proteína A se puede ver que en la segunda calle esta está más pronunciada. Pero al mirar la proteína B también, se observa una pronunciación de ésta tambien en la segunda calle. Muy probablemente, en esta corrida se sembró más cantidad de muestra en la segunda calle que en la primera, por lo tanto no se puede asegurar que la concentración sea mayor.
En el caso de la derecha, al mirar la proteína A se ve una pronunciación en la segunda calle, y al mirar la proteína B se ve que las dos bandas de las diferentes calles son similares. Por lo que se puede decir que no se sembró más en una que en la otra, ya que la proteína B está igual en cantidad, por lo que la proteína A de la muestra de la segunda calle está em mayor concentración que en la de la primera.

En la investigación llevada a cabo por las Dras Mazzetti y Matcovic', ésta técnica fue aplicada para la purificación de receptores de glucocorticoides para su posterior estudio en función de cantidad y calidad en diferentes individuos afectados con inducción de porfiria.
Debido a que la enfermedad ataca al hígado, durante la investigación se quiso estudiar si afectaba a la producción de receptores de glucocorticoides como la corticosterona en animales y el cortisol en humanos. Estos glucocorticoides participan en la regulación del estres, por lo que si hay una falla puede ser, o bien de una mal producción de los glucocorticoides mismos, o bien de una falla en los receptores que no pueden "engancharlos" bien, por lo que no pueden cumplir su función.
Los receptores son proteínas, por lo que se puede usar paea purificarlos y caracterizarlos las técnicas de electroforesis con un revelado por anticuerpos como el descripto más arriba, o por el pegado de un glucocoricoide marcado radioactivamente y su lectura en RIA.

Probando Solventes para una mejor corrida

En la practica de hoy, hicimos cromatografía en capa delgada, probamos diferentes solventes para lograr la mejor corrida. La placa de silicagel venia con indicador de Fluorecencia- 254.
La finalidad de la corrida era la separación de: cortisol de corticosterona. Moléculas que se pueden visualizar más abajo, observándose que se diferencian solamente por un OH-

Para eso decidimos comenzar con una Sc. de 2 ml de Etanol y 0.2 de Agua, sembrando cada una en un lugar de siembra diferente, pero como resultado obtuvimos que ambas tienen el mismo RF
Luego probamos con 2 ml de Metanol y 1 ml de Agua, pensando en hacer más polar al solvente para que corra mas lento y quede más retenido en la placa de silicagel. El resultado de la misma fue positivo, lo sembrado no corrió con el frente pero el problema es que seguían teniendo el mismo RF.
Más tarde probamos con 1 ml de Aceto nitrilo y 2 ml de Metanol, obteniendo un resultado similar al de la solucion anterior pero con mayor distancia entre el frente del solvente y la corrida de la muestra.
Para finalizar y obtener el solvente definitivo de corrida, usamos una Sc. 86 % diclorometano 7% Metanol y 7% Aceto nitrilo. Los resultados obtenidos fueron ideales, se lograron separar las muestras y el RF obtenido fue excelente.

HPLC

Este jueves trabajamos con el HPLC, esta técnica se trata de una cromatografía a alta presión. Es decir, el aparato tiene un sistema de bombeo, mediante el cual hace pasar al solvente elegido por la columna con un cierto caudal a una cierta presión (dependiendo de la relación solvente-columna. Por ejemplo, si hacemos pasar por una columna no polar un solvente que contiene una cantidad considerable de agua, el sistema levantará mas presión ya que el agua al ser polar no se atrae con la columna, en una cromatografía en columna normal tardaría más en salir, pero como en el HPLC el caudal está definido por las bombas, esa "resistencia" a avanzar se traduce en una presión mayor). Conectado a la columna se encuentra un inyector, que es donde se pone la muestra. Esta se inyecta con unas jeringas especiales, se corre una palanquita en del inyector (que hace que el solvente se lleve a la muestra) y ahí se empieza la corrida.

El aparato está conectado a un espectrofotómetro que lee absorbancias en el espectro visible y en el UV, por donde va pasando la muestra y formando una curva. A su vez está conectado a una impresora que va graficando los picos, y que, al final de la corrida, integra el área bajo la curva.
Dos de las corridas que hicimos dieron estas curvas:

Nosotros usamos una solución de corticosterona de 5 µg/µl, inyectamos 5, 10 y 15 microlitros de nuestra solución (correspondientes a 25, 50 y 75 microgramos de corticosterona) y los hicimos correr con metanol como solvente para lograr una curva de calibración (área bajo la curva en función de la masa inyectada). Nuestros resultados fueron los siguientes:

De esta manera, es posible saber la concentración de una muestra incógnita mediante esta técnica, habiendo hecho la corrida, se reemplaza el valor del área obtenido en la curva y así se conoce la masa presente en la muestra. Al saber el volumen inyectado se puede sacar la concentración. Después de hacer la curva de calibración, hicimos una corrida de 10 microlitros con una mezcla de metanol y agua (1/10) y pudimos observar como el tiempo de retención se alargaba y la presión que marcaba el visor era más alta.
Los esteroides son no polares, por lo que si los corremos con un solvente no polar como el metanol, su tiempo de retención va a ser corto, y cuanto más polar sea el solvente, más largo será el tiempo de retención. En general, se busca que el tiempo de retención sea lo mas corto posible, siempre y cuando se conserve la eficacia, ya que cuanto más esté retenida la muestra, más se va a diluir dentro de la columna, y si se tiene poca masa una dilución generará la pérdida de un porcentaje importante de la misma, no pudiendo recuperar lo suficiente para el experimento.
Sin embargo, si se tiene dos moléculas muy parecidas, puede ser que un solvente solo no logre separarlas. Para eso es que se usan las mezclas de solventes, para lograr separar los picos.

La corticosterona es el principal glucocorticoide presente en las ratas, involucrándose en la regulación del metabolismo, las reacciones inmunológicas y las respuestas de estrés.