Reconocimiento de HPLC y FPLC, introducción al proyecto y purificación de proteínas

Tercer día: Jueves 28 de mayo de 2009

Mostracion e introducción a HPLC Y FPLC. Funcionamiento de la columna de FPLC con cloruro de cobalto.

Explicación e introducción en la investigación del tema del proyecto.

-¿Qué síntomas tiene la persona con esta enfermedad?
-¿A que se deben?
-¿Qué son las porfirinas y el hemo?
-Diagrama de la síntesis de Hemo

Introducción a la purificación de proteínas.

1-Datos a tener en cuenta para la realización de una purificación

• Origen de la muestra de partida.
• Procariota Vs. Eucariota
• Animal Vs. Vegetal
• Tejido Vs. Cultivo Celular
• Célula Vs. Organela Subcelular
• Destino o finalidad de la proteína a purificar.
• Para la obtención de anticuerpos
• Para determinar su estructura Sintesis del Hemo
  
• Para determinar su actividad Biológica
• Naturaleza de la proteína a purificar.
• Act. Enzimática Vs. Estructural
• Presencia de determinados grupos funcionales o dominios
• Requerimiento de Co-Factores

  

2-Estrategia general de purificación

• Definir Objetivos
• Definir las propiedades de las proteínas
• Desarrollar ensayos analíticos
• Minimizar el manejo de la muestra en cada paso
• Minimizar el uso de aditivos
• Eliminar contaminantes perjudiciales cuanto antes
• Utilizar una técnica diferente en cada paso
• Minimizar el numero de pasos

SEGUIR UN PROTOCOLO LO MAS SIMPLE Y SENCILLO POSIBLE

3-Comprensión del método: Precipitación de proteínas por exceso de sal

SALTING OUT

¿Qué recordamos de Química Analítica? - Determinación de concentración de proteínas

Segundo dia: Jueves 21 de Mayo de 2009

Realizamos una curva de calibración por el método de Bradford y una por el método de Lowry. Se utilizó como solución patrón 0,5% de BCA. Realizamos las diferentes soluciones para la confección de la curva utilizando micropipetas de 10, de 100 y de 1000 µL, llevando a volumen de 0,1 mL en el caso de Bradford, y de 0,4 mL en el caso de Lowry de volumen final de proteínas.

Fundamento teórico de Bradford:
El azul brillante G-250 Coomasie se adhiere a la proteína, el colorante se torna de rojizo a azulado y el máximo de absorción del colorante pasa de 465 a 595 nm. El cambio de absorbancia a esta longitud de onda es proporcional a la concentración de proteínas. Esto se da porque los reactivos complejan a la proteína.
Ventajas:
Método rápido
Reproducible
Sensible (mucho más que el método de Lowry)
No existe interferencia de cationes, de sulfato de amonio ni de polifenoles ni carbohidratos como la sacarosa
Mide proteínas o péptidos con aproximadamente una masa molecular de 4000 Daltons.
Desventajas:
El complejo proteína colorante puede unirse a las celdas de cuarzo
El color varía con diferentes tipos de proteínas
La proteína estándar debe seleccionarse con mucho cuidado
Interferencia con detergentes

Fundamento del método de Lowry:
Combina la reacción de Biuret con la reducción del reactivo Folin Ciocalteau (ácido fosfomolibdico-fosfotúngsdico) por los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas. El color azul es leído a 750 nm (alta sensibilidad para una concentración protéica baja) o a 500 nm (baja sensibilidad para una concentración proteica alta).
Ventajas:
Muy sensible
Menos afectado por la turbidez de la muestra
Más específico que la mayoría de los otros métodos
Relativamente simple
Desventajas:
El color varía con diferentes tipos de proteínas
El color no es estrictamente proporcional a la concentración de proteínas
La sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos y hexoaminas interfieren con la reacción
Las altas concentraciones de azucares reductores, sulfato de amonio y compuestos de sulfhidrilo interfieren con la reacción.
























CONCLUSION: Conociendo las pendientes de las rectas y el volumen pipeteado de la muestra proteica se podra obtener la concentracion proteica de una muestra incógnita.

Primer día: Jueves 14 de mayo del 2009

Una primera aproximación al trabajo de investigación. Como diseñar un trabajo de investigación? Modelos de experimentación en animales, roedores: ratas , ratones . Trabajos a realizar en el año, y planificación de los próximos dos encuentros.

Temas Vistos:

-¿Por qué y cuáles animales usamos para los estudios científicos?

-La crianza de estos animales y el bioterio.

-¿Cómo trabajar con estos animales?

-Charla de higiene y seguridad a cargo del Dpto. de Higiene y Seguridad de la FCEN -UBA

-¿Cómo y donde descartamos los materiales usados en el laboratorio?