¿Qué recordamos de Química Analítica? - Determinación de concentración de proteínas

Segundo dia: Jueves 21 de Mayo de 2009

Realizamos una curva de calibración por el método de Bradford y una por el método de Lowry. Se utilizó como solución patrón 0,5% de BCA. Realizamos las diferentes soluciones para la confección de la curva utilizando micropipetas de 10, de 100 y de 1000 µL, llevando a volumen de 0,1 mL en el caso de Bradford, y de 0,4 mL en el caso de Lowry de volumen final de proteínas.

Fundamento teórico de Bradford:
El azul brillante G-250 Coomasie se adhiere a la proteína, el colorante se torna de rojizo a azulado y el máximo de absorción del colorante pasa de 465 a 595 nm. El cambio de absorbancia a esta longitud de onda es proporcional a la concentración de proteínas. Esto se da porque los reactivos complejan a la proteína.
Ventajas:
Método rápido
Reproducible
Sensible (mucho más que el método de Lowry)
No existe interferencia de cationes, de sulfato de amonio ni de polifenoles ni carbohidratos como la sacarosa
Mide proteínas o péptidos con aproximadamente una masa molecular de 4000 Daltons.
Desventajas:
El complejo proteína colorante puede unirse a las celdas de cuarzo
El color varía con diferentes tipos de proteínas
La proteína estándar debe seleccionarse con mucho cuidado
Interferencia con detergentes

Fundamento del método de Lowry:
Combina la reacción de Biuret con la reducción del reactivo Folin Ciocalteau (ácido fosfomolibdico-fosfotúngsdico) por los residuos de tirosina y triptófano de las proteínas. El color azul es leído a 750 nm (alta sensibilidad para una concentración protéica baja) o a 500 nm (baja sensibilidad para una concentración proteica alta).
Ventajas:
Muy sensible
Menos afectado por la turbidez de la muestra
Más específico que la mayoría de los otros métodos
Relativamente simple
Desventajas:
El color varía con diferentes tipos de proteínas
El color no es estrictamente proporcional a la concentración de proteínas
La sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos y hexoaminas interfieren con la reacción
Las altas concentraciones de azucares reductores, sulfato de amonio y compuestos de sulfhidrilo interfieren con la reacción.
























CONCLUSION: Conociendo las pendientes de las rectas y el volumen pipeteado de la muestra proteica se podra obtener la concentracion proteica de una muestra incógnita.