Probando Solventes para una mejor corrida

En la practica de hoy, hicimos cromatografía en capa delgada, probamos diferentes solventes para lograr la mejor corrida. La placa de silicagel venia con indicador de Fluorecencia- 254.
La finalidad de la corrida era la separación de: cortisol de corticosterona. Moléculas que se pueden visualizar más abajo, observándose que se diferencian solamente por un OH-

Para eso decidimos comenzar con una Sc. de 2 ml de Etanol y 0.2 de Agua, sembrando cada una en un lugar de siembra diferente, pero como resultado obtuvimos que ambas tienen el mismo RF
Luego probamos con 2 ml de Metanol y 1 ml de Agua, pensando en hacer más polar al solvente para que corra mas lento y quede más retenido en la placa de silicagel. El resultado de la misma fue positivo, lo sembrado no corrió con el frente pero el problema es que seguían teniendo el mismo RF.
Más tarde probamos con 1 ml de Aceto nitrilo y 2 ml de Metanol, obteniendo un resultado similar al de la solucion anterior pero con mayor distancia entre el frente del solvente y la corrida de la muestra.
Para finalizar y obtener el solvente definitivo de corrida, usamos una Sc. 86 % diclorometano 7% Metanol y 7% Aceto nitrilo. Los resultados obtenidos fueron ideales, se lograron separar las muestras y el RF obtenido fue excelente.

HPLC

Este jueves trabajamos con el HPLC, esta técnica se trata de una cromatografía a alta presión. Es decir, el aparato tiene un sistema de bombeo, mediante el cual hace pasar al solvente elegido por la columna con un cierto caudal a una cierta presión (dependiendo de la relación solvente-columna. Por ejemplo, si hacemos pasar por una columna no polar un solvente que contiene una cantidad considerable de agua, el sistema levantará mas presión ya que el agua al ser polar no se atrae con la columna, en una cromatografía en columna normal tardaría más en salir, pero como en el HPLC el caudal está definido por las bombas, esa "resistencia" a avanzar se traduce en una presión mayor). Conectado a la columna se encuentra un inyector, que es donde se pone la muestra. Esta se inyecta con unas jeringas especiales, se corre una palanquita en del inyector (que hace que el solvente se lleve a la muestra) y ahí se empieza la corrida.

El aparato está conectado a un espectrofotómetro que lee absorbancias en el espectro visible y en el UV, por donde va pasando la muestra y formando una curva. A su vez está conectado a una impresora que va graficando los picos, y que, al final de la corrida, integra el área bajo la curva.
Dos de las corridas que hicimos dieron estas curvas:

Nosotros usamos una solución de corticosterona de 5 µg/µl, inyectamos 5, 10 y 15 microlitros de nuestra solución (correspondientes a 25, 50 y 75 microgramos de corticosterona) y los hicimos correr con metanol como solvente para lograr una curva de calibración (área bajo la curva en función de la masa inyectada). Nuestros resultados fueron los siguientes:

De esta manera, es posible saber la concentración de una muestra incógnita mediante esta técnica, habiendo hecho la corrida, se reemplaza el valor del área obtenido en la curva y así se conoce la masa presente en la muestra. Al saber el volumen inyectado se puede sacar la concentración. Después de hacer la curva de calibración, hicimos una corrida de 10 microlitros con una mezcla de metanol y agua (1/10) y pudimos observar como el tiempo de retención se alargaba y la presión que marcaba el visor era más alta.
Los esteroides son no polares, por lo que si los corremos con un solvente no polar como el metanol, su tiempo de retención va a ser corto, y cuanto más polar sea el solvente, más largo será el tiempo de retención. En general, se busca que el tiempo de retención sea lo mas corto posible, siempre y cuando se conserve la eficacia, ya que cuanto más esté retenida la muestra, más se va a diluir dentro de la columna, y si se tiene poca masa una dilución generará la pérdida de un porcentaje importante de la misma, no pudiendo recuperar lo suficiente para el experimento.
Sin embargo, si se tiene dos moléculas muy parecidas, puede ser que un solvente solo no logre separarlas. Para eso es que se usan las mezclas de solventes, para lograr separar los picos.

La corticosterona es el principal glucocorticoide presente en las ratas, involucrándose en la regulación del metabolismo, las reacciones inmunológicas y las respuestas de estrés.

CROMATOGRAFIA DE FILTRACION POR GELES

Es la única Cromatografía de No-adsorción, no hay interacción entre la proteína y la matriz.
La proteína entra y sale. No se puede manejar el procesos para evitar la elución.

Características
*Se utiliza en las últimas etapas de los procesos de purificación de proteína.
*Se utilizan geles porosos que actúan como mallas moleculares que permiten separar las moléculas en función de su tamaño.
*Se utilizan geles microporosos de poliacrilamida o de dextrano, en este caso utilizamos un gel dextrano marca Sephadex (Separation, Pharmacia, dextrano) G-25 , estas pueden adsorver 2,5 ml de agua por gramo de gel seco) y el objetivo del TP fue determinar los parámetros del Gel en la columna , estos son, Vo y Vt para ello se sembró una mezcla de cloruro de cobalto, azul de metileno, y blue dextrano y sacarosa para aumentar la densidad de la muestra y permitir una mejor siembra.

La matriz es un material poroso, con tamaño de poro definido, las partículas más grandes no ingresan en todos los poros, luego tienen un camino más corto que recorrer y eluyen primero, así sucesivamente las más pequeñas tienen un camino mucho mayor.

Vt representa el volumen total del lecho = 10 ml, Vo (4,5 ml, lo calculamos con el volumen de elución del blue dextrano que tiene un PM 2x 106) el volumen de huecos en el lecho y Vs el volumen de solvente dentro de las partículas y Vg el volumen de las partículas de gel.
El volumen de elución del Clo2Co = 8 ml
El volumen de elución de azul de metileno, no se pudeo determinar ya que presento un fenómeno de adsorción con la matriz.

Características de la elución
Se define el coeficiente de partición, Kav: Ve-Vo/VT/Vo y con ello se define el comportamiento de cualquier elyído proteico.
donde : VE volumen al cual eluye la proteína.

Vt = Vo + Vs + Vg

Vs= masa de gel seco x Wr (2,5 ml)
Vg= masa de matriz


Existe una relación lineal entre el logaritmo del tamaño de la proteína (mw) y este coeficiente, Kav:
Kav= Ve-Vo/VT-Vo --> el valor puede estar entre 0 y 1
Calibrando columnas con proteinas de peso molecular conocido puedo determinar el peso molecular de una proteína de mi interés

Aplicaciones
CCromatografía de filtración por geles se puede aplicar en:
Caracterización de proteínas, por su peso molecular (mw, [Da])
Determinación si las proteínas están en forma de dímero u otra más compleja. Se comparan los valores de peso molecular obtenidos por filtración por geles y por electroforesis.
Desalinización de muestras


Purificación de proteínas
Generalmente se utiliza en las últimas etapas, cuando se tiene poco volumen de muestra a tratar, dado que:
La capacidad de esta técnica es baja, sólo un 5-10% del volumen de la columna se puede inyectar como muestra.
La velocidad de flujo es baja , dado que la matriz no resiste mucha presión por sus grandes poros.