HPLC

Este jueves trabajamos con el HPLC, esta técnica se trata de una cromatografía a alta presión. Es decir, el aparato tiene un sistema de bombeo, mediante el cual hace pasar al solvente elegido por la columna con un cierto caudal a una cierta presión (dependiendo de la relación solvente-columna. Por ejemplo, si hacemos pasar por una columna no polar un solvente que contiene una cantidad considerable de agua, el sistema levantará mas presión ya que el agua al ser polar no se atrae con la columna, en una cromatografía en columna normal tardaría más en salir, pero como en el HPLC el caudal está definido por las bombas, esa "resistencia" a avanzar se traduce en una presión mayor). Conectado a la columna se encuentra un inyector, que es donde se pone la muestra. Esta se inyecta con unas jeringas especiales, se corre una palanquita en del inyector (que hace que el solvente se lleve a la muestra) y ahí se empieza la corrida.

El aparato está conectado a un espectrofotómetro que lee absorbancias en el espectro visible y en el UV, por donde va pasando la muestra y formando una curva. A su vez está conectado a una impresora que va graficando los picos, y que, al final de la corrida, integra el área bajo la curva.
Dos de las corridas que hicimos dieron estas curvas:

Nosotros usamos una solución de corticosterona de 5 µg/µl, inyectamos 5, 10 y 15 microlitros de nuestra solución (correspondientes a 25, 50 y 75 microgramos de corticosterona) y los hicimos correr con metanol como solvente para lograr una curva de calibración (área bajo la curva en función de la masa inyectada). Nuestros resultados fueron los siguientes:

De esta manera, es posible saber la concentración de una muestra incógnita mediante esta técnica, habiendo hecho la corrida, se reemplaza el valor del área obtenido en la curva y así se conoce la masa presente en la muestra. Al saber el volumen inyectado se puede sacar la concentración. Después de hacer la curva de calibración, hicimos una corrida de 10 microlitros con una mezcla de metanol y agua (1/10) y pudimos observar como el tiempo de retención se alargaba y la presión que marcaba el visor era más alta.
Los esteroides son no polares, por lo que si los corremos con un solvente no polar como el metanol, su tiempo de retención va a ser corto, y cuanto más polar sea el solvente, más largo será el tiempo de retención. En general, se busca que el tiempo de retención sea lo mas corto posible, siempre y cuando se conserve la eficacia, ya que cuanto más esté retenida la muestra, más se va a diluir dentro de la columna, y si se tiene poca masa una dilución generará la pérdida de un porcentaje importante de la misma, no pudiendo recuperar lo suficiente para el experimento.
Sin embargo, si se tiene dos moléculas muy parecidas, puede ser que un solvente solo no logre separarlas. Para eso es que se usan las mezclas de solventes, para lograr separar los picos.

La corticosterona es el principal glucocorticoide presente en las ratas, involucrándose en la regulación del metabolismo, las reacciones inmunológicas y las respuestas de estrés.