CROMATOGRAFIA DE FILTRACION POR GELES

Es la única Cromatografía de No-adsorción, no hay interacción entre la proteína y la matriz.
La proteína entra y sale. No se puede manejar el procesos para evitar la elución.

Características
*Se utiliza en las últimas etapas de los procesos de purificación de proteína.
*Se utilizan geles porosos que actúan como mallas moleculares que permiten separar las moléculas en función de su tamaño.
*Se utilizan geles microporosos de poliacrilamida o de dextrano, en este caso utilizamos un gel dextrano marca Sephadex (Separation, Pharmacia, dextrano) G-25 , estas pueden adsorver 2,5 ml de agua por gramo de gel seco) y el objetivo del TP fue determinar los parámetros del Gel en la columna , estos son, Vo y Vt para ello se sembró una mezcla de cloruro de cobalto, azul de metileno, y blue dextrano y sacarosa para aumentar la densidad de la muestra y permitir una mejor siembra.

La matriz es un material poroso, con tamaño de poro definido, las partículas más grandes no ingresan en todos los poros, luego tienen un camino más corto que recorrer y eluyen primero, así sucesivamente las más pequeñas tienen un camino mucho mayor.

Vt representa el volumen total del lecho = 10 ml, Vo (4,5 ml, lo calculamos con el volumen de elución del blue dextrano que tiene un PM 2x 106) el volumen de huecos en el lecho y Vs el volumen de solvente dentro de las partículas y Vg el volumen de las partículas de gel.
El volumen de elución del Clo2Co = 8 ml
El volumen de elución de azul de metileno, no se pudeo determinar ya que presento un fenómeno de adsorción con la matriz.

Características de la elución
Se define el coeficiente de partición, Kav: Ve-Vo/VT/Vo y con ello se define el comportamiento de cualquier elyído proteico.
donde : VE volumen al cual eluye la proteína.

Vt = Vo + Vs + Vg

Vs= masa de gel seco x Wr (2,5 ml)
Vg= masa de matriz


Existe una relación lineal entre el logaritmo del tamaño de la proteína (mw) y este coeficiente, Kav:
Kav= Ve-Vo/VT-Vo --> el valor puede estar entre 0 y 1
Calibrando columnas con proteinas de peso molecular conocido puedo determinar el peso molecular de una proteína de mi interés

Aplicaciones
CCromatografía de filtración por geles se puede aplicar en:
Caracterización de proteínas, por su peso molecular (mw, [Da])
Determinación si las proteínas están en forma de dímero u otra más compleja. Se comparan los valores de peso molecular obtenidos por filtración por geles y por electroforesis.
Desalinización de muestras


Purificación de proteínas
Generalmente se utiliza en las últimas etapas, cuando se tiene poco volumen de muestra a tratar, dado que:
La capacidad de esta técnica es baja, sólo un 5-10% del volumen de la columna se puede inyectar como muestra.
La velocidad de flujo es baja , dado que la matriz no resiste mucha presión por sus grandes poros.