La electroforesis consiste en la separación por tamaño, en este caso de proteínas, haciendolas correr por diferencia de carga (estas estan cargadas todas iguales por un tratamiento previo).
Esta técnica se preparan dos geles: el concentrador (no separa las proteínas, simplemente las alínea para que todas empiecen a correr a la vez) y el gel separador (el encargado de separarlas por tamaño)
En una cubeta para electroforesis se llena una una lámina de gel separador, se agrega alcohol arriba para evitar curvaciones en los costados (ya que la corrida va a ser vertical). Se deja solidificar, se tira el alcohol y se agrega el gel concentrador seguido del peine para formar las calles. Una vez que solidifica este segundo gel, se saca el peine y se procede a sembrar las muestras de priteínas previamente desnaturalizadas con SDS (ésto se hace para poder separar bien por peso molecular, y que la forma no influya en la corrida) con micropipeta. En la mezcla a sembrar (una muestra de crackeo, es decir una mezcla de proteínas extraídas desnturalizadas) se agrega azul de bromofenol, que al ser muy pequeño corre con el frente, y como es coloreado nos permite visualizar las instancias de la corrida. En la cubeta se pone el buffer adecuado, que va a proporcionar el medio por el cual puedan moverse las proteínas. En una calle se pone un indicador de bandas, que es como una "regla" que marca los diferentes pesos celulares visiblemente (quedan bandas de colores)
Una vez que el frente llegó abajo, se desarma el equipo, se saca el el gel y con cuidado de que este todo el tiempo mojado con buffer, se transpasa a una memrana. Una vez hecho esto, se deja incubar la membrana con una anticuerpo específico para la proteína de interes, y después de un tiempo, se deja con un segundo anticuerpo que reconoce al primero, pero que está marcado.
En este caso, el segundo anticuerpo tenía peroxidasa, y para el revelado se le agregaba luminol y agua oxigenada, generando una reacción de descomposicion del agua oxigenada combinada con el luminol que genera luz. A la embrana con los anticuerpos se le agregan los reactivos, y se la lleva a revelar. La máquima lo que hace es "sacar una foto" pero a oscuras, es decir, esta todo oscuro, y la máquina reconoce la luz que emite la muestra.
Después, se debe hacer un control de carga. Esto sirve para corroborar la relación de cantidades de proteínas. Es decir, uno puede obtener 2 bandas a la misma altura en dos calles diferentes, una más grande que la otra, pero no necesariamente eso quiere decir que la más grande contenga más concentración, ya que puede haber habido un error al sembrar o un factor externo. Por lo tanto, para corroborar esta diferencia, se revela la misma membrana contra un anticuerpo para otra proteína (una que sé que está presente y no fue modificada en ningún proceso anterior). Para obtener un factor que determine si la concentración es realmente mayor o no, se hace un cociente entre "el ancho" de las bandas de una misma calle (es decir, de las dos dferentes proteínas). Esto se logra con un programa de la computadora, que al seleccionar una cierta superficie, dice "cuan negra" está en unas unidades arbitrarias. Si las concentraciones son similares, el cociente entre los valores de una calle deben ser similares a el de la otra.
En el ejemplo de la izquierda, mirando solamente la proteína A se puede ver que en la segunda calle esta está más pronunciada. Pero al mirar la proteína B también, se observa una pronunciación de ésta tambien en la segunda calle. Muy probablemente, en esta corrida se sembró más cantidad de muestra en la segunda calle que en la primera, por lo tanto no se puede asegurar que la concentración sea mayor.En el caso de la derecha, al mirar la proteína A se ve una pronunciación en la segunda calle, y al mirar la proteína B se ve que las dos bandas de las diferentes calles son similares. Por lo que se puede decir que no se sembró más en una que en la otra, ya que la proteína B está igual en cantidad, por lo que la proteína A de la muestra de la segunda calle está em mayor concentración que en la de la primera.
En la investigación llevada a cabo por las Dras Mazzetti y Matcovic', ésta técnica fue aplicada para la purificación de receptores de glucocorticoides para su posterior estudio en función de cantidad y calidad en diferentes individuos afectados con inducción de porfiria.
Debido a que la enfermedad ataca al hígado, durante la investigación se quiso estudiar si afectaba a la producción de receptores de glucocorticoides como la corticosterona en animales y el cortisol en humanos. Estos glucocorticoides participan en la regulación del estres, por lo que si hay una falla puede ser, o bien de una mal producción de los glucocorticoides mismos, o bien de una falla en los receptores que no pueden "engancharlos" bien, por lo que no pueden cumplir su función.
Los receptores son proteínas, por lo que se puede usar paea purificarlos y caracterizarlos las técnicas de electroforesis con un revelado por anticuerpos como el descripto más arriba, o por el pegado de un glucocoricoide marcado radioactivamente y su lectura en RIA.
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